[发明专利]一种制备、分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法

摘要

本发明涉及乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）的制备，分离与纯化。从禾本，豆，苋，藜，蓼，旋花，十字花，茜草，菊，莎草，唇形，锦葵，泽泻各科植物中培养ＡＬＳ酶。经实验，优化出最佳原料与均匀化溶液的比值，组成和浓度，制成了匀浆过滤，浸取，两步离心，两步盐析，层析或透析脱盐的精细技术流程。获得了最高比活值为２２３μｍ／ｍｇ·hr的ＡＬＳ酶，半衰期７—８天，保存期３０天，满足分子水平的离体农药筛选方法中做为生物催化剂的实用规格要求。

主权项

1.一种制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于主要包括以下顺序步骤：(1)提供禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，沙草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种含乙酰乳酸合成酶的芽和胚组织为原料，与用ALS酶的底物，辅酶，稳定剂和缓冲液配制成的均匀化溶液，在常温常压下混合搅切制成组织匀浆，其中底物用丙酮酸钠，其浓度为10-30μM，原料与均匀化溶液之比为1克：0.2-2.0ml；(2)将组织匀浆过滤，滤渣用均匀化溶液反复浸取多次，合并滤液获得粗酶；(3)粗酶滤液分两步离心分离，离心速度第二步高于第一步，获得离心酶；(4)将离心酶分两步盐析富集，每步都在0-4℃温度下加入硫酸盐，饱和度为30-70％，沉淀离心30分钟，离心速度16,000-20,000转/分，获得离心酶沉淀；(5)用ALS酶的底物，辅酶，缓冲液制成酶团溶解液溶解离心酶沉淀，获得的沉淀酶溶解液可用层析法，也可用透析反透析法纯化，由此得到高纯度的纯化酶，酶团溶解液中的底物用丙酮酸钠，其浓度为1-5mM。