[发明专利]新型人肿瘤坏死因子突变体

摘要

新型人肿瘤坏死因子突变体,涉及基因工程技术,应用PCR技术将人肿瘤坏死因子基因中编码氨基末端的7个氨基酸序列缺失,将编码Pro8Ser9Asp10序列用编码ArglysArg序列取代,同时将Leu157用Phe取代,构建了一种新型人TMP突变体基因,将此突变基因插入大肠杆菌表达载体pBV220,通过温度诱导获得了高效表达。此突变体提高了其抗肿瘤活性,降低其毒副作用将会使人TMF的临床应用成为可能。

主权项

1、新型人肿瘤坏死因子突变体，其特征在于：a.nrhTNF基因克隆：采用亚磷酰胺法合成2条引物，引物1的序列及组成为：5′GCGAATTCATGCGTAAACGTAAGCCTGTAGCC3′EcoRI起始码ArgLysArghTNF11-14位氨基酸编码序列引物2的序列及组成为：5′CGGACGTCTCAGAAGGCAATGATCCC3′PstI终止码PhehTNF156-153位氨基酸编码序列应用含hTNFcDNA的质粒pBVTNF202为PCR扩增模板，经PCR反应，扩增出一长约470bp的DNA片段。将扩增片段经EcoRI和PstI双酶切后，克隆入pUC18和pUC19的EcoRI和PstI酶切位点之间，测定扩增片段的DNA序列，结果表明，该PCR扩增片段与天然人TNF相比较，5′未端缺失了7个氨基酸的编码序列，天然人TNF基因中编码Pro8Ser9Asp10的编码序列由ArgLysArg的编码序列取代，157位Leu的密码子被Phe的密码子取代。b.高效表达载体的构建将含人TNF突变基因的pUC19经EcoRI和PstI双酶切，低熔点琼脂糖回收470bp的DNA片段，插入原核高效表达载体pBV220中。c.工程菌的建立宿主菌为大肠杆菌DH5a。将连接好的pBVnrhTNF用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，LB培养液扩大培养，提取质粒，用EcoRI和PstI双酶切，筛选出目的菌株。d.pBVnrhTNF在大肠杆菌中的表达将经筛选后的pBVnrhTNF/DH5a30℃培养，42℃诱导5小时，菌体经载样缓冲液处理。进行SDS-PAGE电泳，染色，脱色，干胶后扫描分析，在分子量16.5KD左右处有明显表达条带，此带占菌体总蛋白的67.4％。e.nrhTNF实验室纯化pBVnrhTNF/DH5a表达菌经诱导后收集菌体。菌体用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)2SO4达50％饱和度，上清用10mmol/Tris·ClpH8.5，1mmol/LEDTA充分透析。粗提液经Q-Sepherose柱层析，0-0.5mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集含有nrhTNF的第一峰。透析除盐后，经S-Sepherose柱层析，0-1mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集nrhTNF活性峰，稀释，过滤，分装，冷冻干燥。